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    隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥逐漸得到世界的認(rèn)可。中藥以其充足的資源、獨(dú)特的療效、微弱的不良反應(yīng)等優(yōu)勢，在保護(hù)人類健康方面具有重要作用。中藥材作為中藥產(chǎn)業(yè)的核心資源，其質(zhì)量安全已受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。中藥材在種植、采收、貯存及加工等一系列過程中，均可能受到真菌污染產(chǎn)生真菌毒素，真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的天然有毒化合物，主要包括黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和伏馬毒素類等，近年來，多項(xiàng)研究表明中藥材容易受到以上真菌毒素的污染，如何保證中藥材質(zhì)量安全已成為中醫(yī)藥行業(yè)亟需解決的重大難題。預(yù)防和控制中藥生產(chǎn)質(zhì)量和用藥安全尤為重要，真菌毒素多組分、高通量的快速檢測技術(shù)亟待開發(fā)。

    本文依據(jù) 2020 年版《中國藥典》 “2351 真菌毒素測定法”中“六、多種真菌毒素測定法”中的內(nèi)容，建立了使用譜育科技自主研發(fā)生產(chǎn)的超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 EXPEC 5210 測定西瓜霜中 28 種真菌毒素化合物含量的快速且高靈敏度的檢測方法，為西瓜霜中真菌毒素類化合物含量檢測提供參考。

樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、試劑和設(shè)備

    儀器：EXPEC 5210 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；

    樣品：西瓜霜；

    標(biāo)準(zhǔn)品：28 種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品購于天津阿爾塔；

    試劑：甲醇、甲酸、均為色譜純，水為超純水。

液相和質(zhì)譜條件

正離子：

監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)

負(fù)離子：

監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)

樣品前處理

    西瓜霜按照 2020 年版《中國藥典》“2351 真菌毒素測定法”中“六、多種真菌毒素測定法”前處理方式進(jìn)行，取供試品粉末約 5g（過二號篩），精密稱定，精密加入 70%甲醇溶液 50ml，超聲處理 30 分鐘，離心，精密量取上清液 10ml，用水稀釋至 20ml，搖勻。精密量取 3ml，緩慢通過已經(jīng)處理好的 HLB 柱[規(guī)格：3ml（60mg），依次用甲醇和水各 3ml 洗脫]，直至有適量空氣通過，收集洗脫液；隨后用 3ml 甲醇洗脫，收集洗脫液，合并兩次洗脫液，于 40℃氮?dú)饩徛抵两?，?0.2%乙酸/（乙腈：水=1:1）溶液定容至 1ml，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

典型色譜圖

按照上述 2.2 條件上機(jī)測試，真菌毒素的典型色譜圖，如圖 1 和圖 2 所示。

圖 1 正離子模式下真菌毒素典型色譜圖（以 DON 計(jì)，3ng/ml）

圖 2 負(fù)離子模式下真菌毒素典型色譜圖（以玉米赤霉烯酮計(jì)，3ng/ml）

 線性和檢出限

    標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制：以空白西瓜霜基質(zhì)配制系列梯度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在對應(yīng)的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù) r值均在 0.995 以上。

    以線性曲線最低點(diǎn)進(jìn)樣，定量限具體結(jié)果如表 3 和 4 所示。由表 3 和 4 可知，28 種真菌毒素定量限在 0.05μg/kg-5μg/kg 之間，均達(dá)到藥典中規(guī)定的定量限要求。

表 4 正離子模式下部分真菌毒素靈敏度

表 4 負(fù)離子模式下真菌毒素靈敏度

重復(fù)性

    從真菌毒素儲備液中吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，以空白西瓜霜基質(zhì)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線低（標(biāo)曲點(diǎn) 4）、中（標(biāo)曲點(diǎn) 7）、高濃度（標(biāo)曲點(diǎn) 9）的對照品，進(jìn)樣 7 次，考察峰面積的重復(fù)性。真菌毒素的保留時間 RSD 在 0.38%以下，峰面積 RSD均在 8%以下，精密度較好。

回收率

    從真菌毒素儲備液中吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過 2.3 樣品前處理得到回收率。其中 OTA（赭曲霉毒素 A）回收率為 64.78%，AFB1 回收率為 61.97%，其他真菌毒素的回收率均在 72.84% -108.02%之間。

樣品測試

    按照 2.3 中樣品制備方法處理樣品，批處理結(jié)果如下圖所示，結(jié)果表明西瓜霜中未有 28種真菌毒素檢出。

結(jié)語

    本實(shí)驗(yàn)依據(jù) 2020 年版《中國藥典》考察了 28 種真菌毒素的線性、精密度、靈敏度、回收率等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 28 種真菌毒素相關(guān)系數(shù) r 均大于 0.995，線性良好；28 種真菌毒素定量限在 0.05μg/kg-5μg/kg 之間。在低、中和高的濃度下，連續(xù)進(jìn)樣七針 28 種真菌毒素的保留時間 RSD 在 0.38%以下，峰面積 RSD 均在 8%，精密度較好，并且在低、中和高的濃度下，28 種真菌毒素的回收率在 61.97%-108.02%之間。由此可見，使用譜育科技高靈敏、高抗污染能力的 EXPEC5210 系統(tǒng)可以對西瓜霜中的 28 種真菌毒素殘留量進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、靈敏的定量檢測。

附錄

EXPEC 5210 型 LC-MSMS 配置清單